Microscopia de luz em microbiologia

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1. Taxonomia e nomenclatura de microrganismos

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Capítulo 1

Taxonomia e nomenclatura de microrganismos objetivos

Aprender sobre a classificação dos microrganismos.

Entender as relações filogenéticas existentes entre os microrganismos.

Conhecer os reinos desses organismos e a forma como é feita sua classificação.

Entender sobre a classificação de bactérias.

CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS

A ciência da classificação, especialmente a classificação de seres vivos, é denominada taxonomia, do grego taxis (arranjo) e nomos (lei, ordem). Assim, o objetivo da taxonomia é classificar organismos vivos, ou seja, estabelecer as relações entre os grupos de organismos e diferenciá-los. Com relação aos microrganismos, devido a poucos registros fósseis, a sua classificação ainda está longe da ideal.

Um sistema taxonômico nos possibilita identificar um organismo previamente desconhecido e, então, agrupá-lo ou classificá-lo com outros organismos que possuam características similares. A taxonomia também fornece uma referência comum na identificação de organismos. Por exemplo, quando uma bactéria suspeita é isolada de um paciente, características daquele isolado são comparadas a uma lista de características de bactérias previamente classificadas para identificar a amostra. Depois de a bactéria ser identificada, drogas que a afetam podem ser selecionadas. Portanto, a taxonomia é uma ferramenta básica e necessária para os cientistas e fornece uma linguagem universal de comunicação.

 

2. O microscópio

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Capítulo 2

O microscópio

Capítulo 2

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O microscópio objetivos

Familiarizar-se com a estrutura do microscópio.

Rever as precauções a se tomar com a sua utilização.

Conhecer o emprego da objetiva de imersão.

No dia em que Antonie van Leeuwenhoek inventou este maravilhoso instrumento que é o microscópio, um universo de seres infinitamente pequenos, até o momento desconhecido, passou a ser observado. Uma nova ciência, a microbiologia, nascia.

O microscópio é o instrumento mais útil e o mais importante para o microbiologista. Este capítulo foi concebido para que o estudante venha a se familiarizar com esse recurso e a utilizá-lo adequadamente e da melhor maneira possível na observação dos microrganismos que serão estudados nos capítulos subseqüentes.

ESTRUTURA DO MICROSCÓPIO

A microbiologia pode ser definida como o estudo de organismos que são muito pequenos para serem vistos claramente pelo olho humano sem ajuda alguma. Para a visualização de microrganismos necessita-se de aumentos, os quais são conseguidos com o uso do microscópio óptico composto.

 

3. Estudo da célula bacteriana: fixação e coloração

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Capítulo 3

Capítulo 3

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Estudo da célula bacteriana

Estudo da célula bacteriana: fixação e coloração objetivos

Familiarizar-se com as diversas formas e arranjos celulares dos microrganismos por meio da coloração com corantes apropriados.

Entender e observar que as colorações são um recurso fundamental para o reconhecimento dos diversos tipos morfológicos microbianos.

Os microrganismos apresentam formas típicas, que servem para seu reconhecimento, revelando-se esféricos (cocos), retangulares ou na forma de bastonetes (bacilos), encurvados (espirilos) e na forma de vírgula (vibriões). Uma estrutura rígida, denominada parede celular, confere aos microrganismos a sua forma original.

Para a familiarização com essas formas bacterianas, preparados de amostras fixados e corados tornam-se um material adequado para essas observações. Assim, faz-se necessário colorir as células, já que estas são normalmente incolores.

DELINEAMENTO

1.

2.

3.

MATERIAL

• Lâminas de microscópio (lâminas de vidro apropriadas)

• Lápis para vidro ou etiquetas apropriadas

 

4. Bacilos gram-positivos e bacilos gram-negativos

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5. Staphylococcus spp.

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Capítulo 5

Staphylococcus spp. objetivos

Observar esfregaços corados por Gram.

Conhecer a morfologia e o arranjo celular de cocos gram-positivos (estafilococos).

Os estafilococos (do grego Staphyle, uva) pertencem à família Micrococcaceae e ao gênero Staphylococcus. São cocos gram-positivos, imóveis, agrupados em massas irregulares ou formas semelhantes a cachos de uva. São aeróbios ou anaeróbios facultativos e catalase-positivos. Fermentam a glicose com produção de ácido, tanto em aerobiose como em anaerobiose.

Com relação à morfologia, são células esféricas de cerca de um µm de diâmetro (estafilococos patogênicos) ou maiores e desiguais (estafilococos ou micrococos saprófitas). As culturas jovens de certas cepas podem exibir cápsula, porém, de um modo geral, consideram-se os estafilococos como acapsulados.

Gram-positivos nas culturas recentes, tendem a perder essa propriedade nas culturas velhas.

Os estafilococos crescem bem nos meios de culturas mais comuns, como o caldo simples ou ágar simples, com pH 7, à temperatura ótima de 37ºC. Em placa de ágar simples, após 24 horas na estufa a 37ºC, produzem colônias de cerca de 1 a 3 mm de diâmetro, convexas, de superfície livre e bordos circulares, opacas e brilhantes. Deixando-se as placas um ou dois dias à temperatura ambiente, as culturas de estafilococos patogênicos recém-isoladas geralmente desenvolvem um pigmento amarelo, ao passo que os estafilococos saprófitas formam colônias brancas.

 

6. Enterobactérias (Escherichia spp.)

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Capítulo 6

Capítulo 6

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Enterobactérias

Enterobactérias

(Escherichia spp.) objetivos

Observar esfregaços corados por Gram.

Conhecer a morfologia e o arranjo celular de enterobactérias.

O microrganismo Escherichia coli é constituído por células em forma de bastonetes retos, de 1,1 a

1,5 por 2 a 6 µm. Caracteriza-se por ser móvel por flagelos peritríqueos ou imóvel, gram-negativo, anaeróbio facultativo e não-formador de esporos.

Pertence à família Enterobacteriaceae e o gênero

Escherichia.

PATOGENIA

Escherichia coli é um microrganismo presente no trato gastrintestinal dos animais de sangue quente, fazendo parte da microbiota intestinal normal. No entanto, algumas linhagens desse microrganismo podem ser patogênicas, recebendo, nesses casos, a denominação genérica de Escherichia coli enterovirulenta. Conhecem-se quatro linhagens diferentes, de acordo com a natureza da infecção que podem provocar:

1.

Linhagem E. coli invasora: os microrganismos dessa linhagem são, em geral, inócuos em seu hábitat natural, mas podem causar problemas se alcançarem outros locais ou tecidos do hos-

 

7. Bacilos gram-positivos (Bacillus spp.)

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Capítulo 7

Bacilos gram-positivos

(Bacillus spp.) objetivos

Observar esfregaços corados por Gram.

Conhecer a morfologia e o arranjo celular de bacilos gram-positivos (Bacillus spp.).

Os bacilos gram-positivos são encontrados largamente na natureza, habitando o solo, a água, a pele e as mucosas de vários animais, inclusive do homem. A virulência desses microrganismos varia muito entre as espécies. Neste grupo incluem-se desde

Bacillus anthracis (agente do carbúnculo hemático) e Corynebacterium diphteriae (agente da difteria) até

Lactobacillus acidophillus (não-patogênico).

BACILLUS SPP.

Pertencem à família Bacillaceae e ao gênero

Bacillus. São bacilos gram-positivos, móveis ou imóveis, formadores de esporos resistentes a condições ambientais adversas, tais como calor e baixos níveis de umidade. São aeróbios ou anaeróbios facultativos, e a maioria das espécies encontradas em laboratório é saprófita.

PRINCIPAIS ESPÉCIES

Bacillus anthracis

É o agente do carbúnculo hemático, uma zoonose transmissível aos humanos, que geralmente ocorre em animais (gado, ovelhas, cabras, camelos e outros herbívoros). Ganhou grande importância clínica

 

8. Sarcina spp.

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Capítulo 8

Capítulo 8

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Sarcina spp.

Sarcina spp. objetivos

Observar esfregaços corados por Gram.

Conhecer a morfologia, o arranjo celular e as características de Sarcina spp.

Esses microrganismos pertencem à família:

Halobacteriaceae e ao gênero Sarcina. São espécies distribuídas amplamente na natureza e são isoladas comumente do intestino de mamíferos e de semen-

Figura 8.1 Cocos gram-positivos agrupados no vértice de um cubo.

A

tes de cereais (S. ventriculi e S. maxima). As saprófitas contaminantes usuais dos meios de cultura são

S. lutea, S. flava e S. aurantiaca.

Com relação à morfologia, trata-se de células esféricas de cerca de 1,8 a 3 µm de diâmetro. As células se dividem em três planos, em um padrão regular, formando um arranjo cúbico de células (grupo de oito células esféricas) (Figura 8.1). Portanto, são cocos gram-positivos agrupados no vértice de um cubo, anaeróbios, catalase-negativos, imóveis, e geralmente não formam esporos. Algumas células podem ocorrer isoladamente, ou ainda formando pares ou tétrades.

 

9. Leveduras

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Capítulo 9

Leveduras objetivos

Observar células leveduriformes in vivo.

Reconhecer as células em divisão (brotamento).

Saber sobre a morfologia e a estrutura celular dessas células.

A morfologia celular das leveduras é muito variável. Geralmente, são unicelulares, apresentando forma oval ou cilíndrica (Figura 9.1). Outras formas podem ser encontradas, como esférica, elíptica, elipsóide ou filamentosa (pseudomicélio constituído por células unidas entre si).

As leveduras apresentam membrana celular bem definida e pouco espessa em células jovens. Em células adultas, essa membrana é rígida de constituição variável, com predominância de hidratos de carbono e menor quantidade de proteínas e ácidos graxos. Principalmente em células em fase de reprodução, o núcleo é bem definido: pequeno, esférico, de localização variável, associado ao vacúolo nuclear (Figura 9.2).

As leveduras são classificadas como fungos pertencentes à divisão Eumycota (Eumicetos) e às classes Ascomicetos, Basidiomicetos e Deuteromicetos.

 

10. Candida spp.

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Capítulo 10

Candida spp. objetivos

Tomar conhecimento do gênero Candida spp.

Aprender sobre sua taxonomia e sobre suas características morfológicas e culturais.

Conhecer as espécies patogênicas, os fatores que levam ao aparecimento de doenças, suas manifestações clínicas e como é feito o diagnóstico.

Observar esfregaços corados por Gram.

Leveduras do gênero Candida, da família Criptococacea, são fungos que ocorrem em todo o mundo, tanto no solo quanto em plantas vivas ou mortas. São saprófitas, ou seja, convivem normalmente com o ser humano saudável em locais como a vagina, a boca e a pele. São encontradas na saliva de 30 a 60% dos indivíduos sadios.

Com relação a suas características morfológicas e culturais, em meio sólido, como o Sabouraud Dextrose Ágar (SDA), as colônias se apresentam cremosas e com coloração branca ou bege. Para observação de estruturas microscópicas, a levedura deve ser cultivada em meios pobres, como o ágar-fubá e o ágarbatata. Na micromorfologia, podem ser observadas ao microscópio estruturas como blastoconídios, com ou sem brotamentos, clamidoconídios e pseudo-hifas – que se formam quando os blastoconídios que nascem se alongam e não se desprendem da célula que os originou.

 

11. Micobactérias

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Capítulo 11

Capítulo 11

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Micobactérias

Micobactérias objetivos

Conhecer as micobactérias, sua classificação e sua patogenia.

Observar esfregaços corados pelo método de Ziehl-Neelsen.

Reconhecer os bacilos álcool-ácido resistentes.

As micobactérias são bacilos aeróbios, imóveis e não-esporulados. Não são corados com facilidade por Gram e resistem a agentes descorantes durante a técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, sendo, por isso, chamados de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR).

Outra característica desses microrganismos é o crescimento lento de algumas espécies em meios especiais a 37ºC, enquanto formas saprófitas crescem rapidamente na maior parte dos meios de cultura a 37ºC e a 22ºC. A maior parte das micobactérias é responsável por infecções nos pulmões e na pele, assim como em outros órgãos. Pertencem à família Mycobacteriaceae e ao gênero Mycobacterium. Atualmente, esse gênero compreende oito espécies.

PATOGENIA

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

É o microrganismo causador da tuberculose humana. Os bacilos têm de 1 a 4 µm de comprimento e apresentam-se isoladamente ou em pequenos grupos.

 

12. Parede celular e esporos

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Capítulo 12 objetivos

Parede celular e esporos

Conhecer a parede celular bacteriana, sua estrutura e sua composição.

Tomar conhecimento do método de coloração dessa estrutura bacteriana (método de Robinow).

Saber sobre os esporos ou endosporos e sua estrutura.

Aprender sobre o método de coloração dos esporos (método de Wirtz-Conklin).

PAREDE CELULAR

A parede celular bacteriana é uma estrutura rígida que recobre a membrana citoplasmática e confere forma às bactérias. Ela é constituída por ácido diaminopimérico (DPA), ácido murâmico e ácido teicóico, além de aminoácidos, carboidratos e lipídeos.

Todos esses compostos estão reunidos para formar substâncias poliméricas complexas que, por sua vez, estruturam a parede celular. Uma macromolécula complexa denominada peptideoglicano (também chamada de mucopeptídeo ou mureína) forma a estrutura rígida da parede. Além disso, a parede celular protege a célula, mantém a pressão osmótica intrabacteriana, impedindo o rompimento da célula devido à entrada de água, e funciona como suporte de antígenos somáticos bacterianos.

 

13. Saliva e espiroquetas

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Capítulo 13

Saliva e espiroquetas objetivos

Reconhecer esfregaços corados por Gram de material proveniente da saliva.

Entender seu conteúdo e seu significado.

Conhecer as espiroquetas e seus principais gêneros.

Observar esfregaços de placa subgengival corados pelos métodos de Fontana-Tribondeaux e de Ryu.

SALIVA

A saliva é um fluido oral composto por elementos orgânicos e inorgânicos que banha as superfícies da cavidade bucal. Um mL de saliva pode conter mais de 200 milhões de microrganismos, representando mais de 1.000 espécies diferentes de bactérias. Os microrganismos presentes na saliva seriam aqueles desalojados dos diferentes sítios da cavidade bucal

(dentes, língua, mucosas). A saliva tem servido como fonte principal para isolamento de microrganismos cariogênicos na grande maioria dos estudos. Isso se deve, principalmente, à facilidade de coleta e manipulação das amostras e à crença de que a saliva contém microrganismos de todos os nichos da cavidade oral.

As espiroquetas compreendem três gêneros importantes: Treponema, Leptospira e Borrellia. Coramse fracamente pelas colorações usuais em microbiologia, inclusive por Gram. De fato, esses microrganismos não possuem afinidade com os corantes comumente empregados, razão pela qual coram-se com muita dificuldade. Como apresentam largura muito pequena, são dificilmente visualizados, necessitando de métodos de impregnação para facilitar sua observação, como o método de coloração de FontanaTribondeaux e o de Ryu.

 

14. Estreptococos

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Capítulo 14

Estreptococos

Capítulo 14

73

Estreptococos objetivos

Conhecer os estreptococos, sua classificação e suas principais espécies.

Observar esfregaços corados por Gram.

Conhecer a estrutura da cápsula bacteriana e seu método de coloração.

Observar esfregaços corados pelo método de Hiss.

Estreptococos são cocos gram-positivos que se arranjam aos pares ou em cadeias. A maioria das espécies é anaeróbia facultativa, geralmente não apresenta motilidade e não forma endosporos. Várias espécies estão presentes na microbiota normal residente, sendo algumas delas patogênicas, associadas a infecções em humanos. Pertencem à família Streptococcaceae e ao gênero Streptococcus.

CÁPSULA

A cápsula bacteriana é um envoltório viscoso, externo à parede celular bacteriana, cuja função é conferir resistência e patogenicidade. É formada principalmente de polissacarídeos. Pode ser verdadeira, quando independe do meio (Streptococcus pneu-

PRINCIPAIS ESPÉCIES DE ESTREPTOCOCOS

S. pneumoniae (ou pneumococos): é o principal agente de infecções comunitárias do trato respiratório, sendo responsável por cerca de 40 a 60% dos casos de pneumonias bacterianas com mortalidade, que pode atingir 20% entre os casos graves com internação hospitalar.

 

15. Leveduras de interesse industrial

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Capítulo 15

Leveduras de interesse industrial

Capítulo 15

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Leveduras de interesse industrial objetivos

Conhecer o gênero Saccharomyces e sua importância.

Saber sobre uma espécie de Candida spp. não-patogênica de interesse industrial.

Observar esfregaços corados por Gram de ambos os gêneros.

GÊNERO SACCHAROMYCES

Espécies de leveduras do gênero Saccharomyces são organismos que se reproduzem assexuadamente por brotamento. S. cerevisiae é a espécie mais conhecida, utilizada pela humanidade há milênios para a fabricação de pães (o dióxido de carbono produzido pelo crescimento na massa faz com que o pão cresça). Os brotos que são formados são inicialmente menores que a célula-mãe, podendo crescer até seu tamanho e, eventualmente, separando-se dela pela formação de um septo. Devido à sua capacidade de fermentar diferentes substratos, outras espécies são utilizadas amplamente na indústria para a produção de cervejas e vinhos, além de outras bebidas alcoólicas e do próprio etanol. Leveduras do gênero Saccharomyces são membros da divisão (ou do filo) Ascomycota, devido à capacidade de produção de ascos. Ascos são estruturas de reprodução sexuada em forma de bolsas que contêm inúmeros esporos sexuados, chamados ascósporos.

 

16. Fungos pluricelulares (miceliais)

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Capítulo 16

Capítulo 16

81

Fungos filamentosos e unicelulares

Fungos pluricelulares

(miceliais) objetivos

Conhecer fungos miceliais, suas características e sua taxonomia.

Diferenciar essas estruturas (micélio) dos fungos unicelulares.

Observar lâminas permanentes de fungos pelo método de microcultivo (descrito no capítulo 44).

Durante muito tempo os fungos permaneceram enquadrados no Reino Plantae (ou Vegetalia) em decorrência de algumas de suas características serem semelhantes às das plantas. Porém, Whittaker, em

1969, propôs enquadrá-los em um reino à parte, que foi denominado Reino Fungi. Essa classificação se baseou em características fúngicas que os diferem das plantas e de outros organismos, tais como a parede celular, que é composta de quitina e não de celulose, o armazenamento de glicogênio, e não de amido como nas plantas, o fato de que não sintetizam clorofila e, portanto, são heterotróficos e o fato de a membrana celular conter ergosterol.

Os fungos têm grande participação na vida humana, estando envolvidos em diversos processos industriais e na biotecnologia, incluindo a fabricação de bebidas como a cerveja e o vinho, a produção do

 

17. Normas gerais de laboratórios de microbiologia

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Capítulo 17

Normas gerais de laboratórios de microbiologia objetivos

Reconhecer as normas adotadas em um laboratório de microbiologia.

Aprender as regras básicas da atividade laboratorial e os cuidados com segurança.

Observar atentamente os cuidados a serem tomados com microrganismos.

A aula prática de Microbiologia tem como objetivo ensinar ao estudante os princípios e os métodos utilizados em um laboratório de microbiologia. Nessas aulas, trabalha-se com uma variedade de bactérias, algumas delas patogênicas para o homem, o que justifica os cuidados e serem tomados no laboratório de microbiologia, a fim de se evitar contaminação de estudantes, professores e funcionários.

DEZ NORMAS PARA O TRABALHO

EM UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

1.

2.

Desinfetar a bancada de trabalho no início e no término das atividades. Para essa finalidade, utiliza-se álcool comercial ou outros desinfetantes disponíveis. Com esse procedimento, os microrganismos que poderiam contaminar as culturas e os microbiologistas na área de trabalho são removidos.

 

18. Materiais e equipamentos

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Capítulo 18

Materiais e equipamentos objetivos

Reconhecer materiais e equipamentos utilizados em laboratórios de microbiologia.

Aprender as características específicas de alguns materiais usados nos laboratórios que envolvem a atividade com microrganismos.

Além dos equipamentos indispensáveis em um laboratório de microbiologia, tais como microscópio, estufas incubadoras, estufas esterilizadoras, autoclaves, geladeiras, balanças, potenciômetro, agitador oscilatório, destilador de água, centrífuga, banhomaria e filtro Seitz, são necesários vidraria específica e outros materiais a saber:

• Tubos de Cultura – destinados ao cultivo de microrganismos em pequeno volume de meio, são tubos de vidro de 16 x 160 mm, 18 x 180 mm, etc.

O tamanho pode variar de acordo com o trabalho a ser desenvolvido, e o vidro deve ser de boa qualidade, neutro, transparente e inalterável aos tratamentos.

• Placas de Petri – são caixas redondas de vidro com tampa, rasas, medindo geralmente 15 mm de altura por 100 mm de diâmetro. Servem para conter o meio de cultura sólido, sendo que sua superfície facilita o isolamento de microrganismos em colônias.

 

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